Puromycin Solution（10mg/ml）

嘌呤霉素溶液(10mg/ml)

 CAS: 58-58-2          Formula: C₂₂H₂₉N₇O₅·2HCl          MW: 544.43

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

Puromycin是來源于Streptomyces alboniger的一種氨基核苷類抗生素，中文名為嘌呤霉素，常用于篩選能夠表達(dá)pac基因（puror）的細(xì)胞。pac基因表達(dá)嘌呤霉素N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(Puromycin N-acetyl-tranferase)，如果該基因表達(dá)，就會(huì)對(duì)嘌呤霉素產(chǎn)生抗性，這一特性目前普遍應(yīng)用于篩選表達(dá)pac基因的哺乳動(dòng)物穩(wěn)定細(xì)胞株。目前，很多商業(yè)化的慢病毒載體都攜帶pac基因(一般在質(zhì)粒圖譜上標(biāo)記為puror)，可以利用嘌呤霉素的篩選，得到特定基因穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株。嘌呤霉素也可以用來篩選表達(dá)pac基因的大腸桿菌菌株、酵母菌株等。Puromycin不僅能用于穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選，也用于穩(wěn)定細(xì)胞株的維持。Puromycin的作用特點(diǎn)是快速作用于細(xì)胞，一般2天內(nèi)可以殺死99%的不表達(dá)pac基因的細(xì)胞。

本產(chǎn)品濃度為10mg/ml，已過濾除菌，可以直接用于細(xì)胞培養(yǎng)。

使用說明：

一、推薦工作濃度：

推薦的作用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的嘌呤霉素濃度一般為1-10μg/ml，但最佳工作濃度需要通過劑量反應(yīng)曲線來確定。 

二、嘌呤霉素劑量反應(yīng)曲線的確定(以shRNA轉(zhuǎn)染或者慢病毒感染為例）：

嘌呤霉素的有效篩選濃度與細(xì)胞類型、生長(zhǎng)狀態(tài)、細(xì)胞密度、細(xì)胞代謝及細(xì)胞所處細(xì)胞周期等因素相關(guān)。為了篩選到穩(wěn)定表達(dá)的shRNA或感染病毒的細(xì)胞株，確定殺死未轉(zhuǎn)染/感染細(xì)胞的最低濃度嘌呤霉素非常重要。對(duì)于初次使用的細(xì)胞，一般需要通過實(shí)驗(yàn)來確定適合自身實(shí)驗(yàn)體系的劑量反應(yīng)曲線(dose-response curve or kill curve)。

1、第一天：24孔板中以5~8×10⁴cells/孔的密度接種細(xì)胞，接種夠量的孔以便進(jìn)行后續(xù)的劑量梯度實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜。

2、第二天： 在培養(yǎng)過夜后的細(xì)胞中更換新鮮配制的篩選培養(yǎng)基，該篩選培養(yǎng)基為含不同濃度嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基(如0、1、2.5、5、7.5、10μg/ml等)，更換培養(yǎng)基后在細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

3、第三天后：由于嘌呤霉素可以快速作用于細(xì)胞，一般2天內(nèi)可以殺死99%的未表達(dá)pac基因的細(xì)胞，所以在加嘌呤霉素后的1-2天就可以進(jìn)行觀察細(xì)胞存活率，從而確定有效殺死正常細(xì)胞的藥物最低濃度。如果細(xì)胞耐藥性比較強(qiáng)，需要每日觀察，一般4-10天內(nèi)即可確定嘌呤霉素的最低濃度。

三、哺乳動(dòng)物穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的篩選：

轉(zhuǎn)染含有pac基因的質(zhì)?；蛘吒腥竞性摶虻牟《竞螅纯珊Y選穩(wěn)定表達(dá)株。

1、細(xì)胞轉(zhuǎn)染或感染48小時(shí)后，將細(xì)胞置于含有適當(dāng)濃度嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)，此為處理組。

注意：當(dāng)細(xì)胞處于分裂活躍期時(shí)，抗生素作用最明顯。細(xì)胞過于密集，抗生素產(chǎn)生的效力會(huì)明顯下降，所以細(xì)胞的密度最好不超過25%。建議同時(shí)做一個(gè)正常細(xì)胞的對(duì)照組。轉(zhuǎn)染或感染48小時(shí)后，如果細(xì)胞過密也可以消化后重新接種細(xì)胞，培養(yǎng)過夜后即可進(jìn)行嘌呤霉素篩選。

2、每隔2-3天，更換含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基。

3、篩選7天后，對(duì)照組正常細(xì)胞應(yīng)該100%死亡，處理組中存活的細(xì)胞為表達(dá)pac基因的細(xì)胞。然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行多克隆或單克隆細(xì)胞的篩選。

注意：每日進(jìn)行細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)的觀察。嘌呤霉素的篩選至少需要24小時(shí)，有效濃度嘌呤霉素的篩選周期一般在2-10天。

4、待細(xì)胞可以穩(wěn)定生長(zhǎng)后，嘌呤霉素的濃度可以減半用于后續(xù)的培養(yǎng)。在得到穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株后，一般建議嘌呤霉素也須持續(xù)加入，并2-3天更換含有嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)液。

注意事項(xiàng)：

為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

保存條件:

         -20℃保存，一年有效，盡量避免反復(fù)凍融。