Total RNA Isolation Reagent

總 RNA 提取試劑    

產(chǎn)品簡介：

本產(chǎn)品采用和 Invitrogen 公司的 Trizol 相似的原理和方法，抽提的方法和步驟完全相同，用于細(xì)胞或組織總 RNA 抽提的試劑。TRI Reagent 能很好提取動(dòng)物細(xì)胞或組織及細(xì)菌的總 RNA；但對(duì)植物組織 RNA 的提取有選擇性。模式植物（擬南芥，小麥，煙草，玉米，大豆）能提取較好的 RNA。一些多糖多酚含量高的植物（西紅柿，銀杏，梧桐，毛白楊，棉花等）葉片使用 TRI Reagent 不能提取 RNA。建議使用 TRI Reagent 提取植物 RNA 時(shí)，要做 RNA 提取的預(yù)實(shí)驗(yàn)操作。

TRI Reagent 可以抽提長達(dá) 15 kb 的 RNA，也可以抽提 microRNA等小RNA。抽提小 RNA 時(shí)宜-70℃沉淀過夜。抽提所得 RNA無 DNA和蛋白污染。一般所得 RNA 溶于 DEPC 水后的 A260/280 值為 1.8-2.0。每一百萬細(xì)胞可得 5-15µg RNA；每毫克組織可得1-10µg RNA。產(chǎn)量因細(xì)胞和組織不同而異。TRI Reagent 抽提所得 RNA 可直接用于 Northern，點(diǎn)雜交，純化 mRNA，體外翻譯，RNase protein assay，cDNA 克隆，以及 RT-PCR，也可用于基因表達(dá)芯片分析，高通量測序等對(duì) RNA 質(zhì)量較高的情況。

使用方法：

1、細(xì)胞裂解或組織勻漿。

（1）貼壁細(xì)胞

吸盡培養(yǎng)液，每 10 平方厘米細(xì)胞加入 1ml TRI Reagent。一般六孔板每孔加 1ml，12 孔板每孔加 0.5ml?；蝿?dòng) 3-5 下，再用槍吹打2-3 下，確保全部裂解，然后吸至離心管中。

（2）懸浮細(xì)胞

離心收集細(xì)胞，吸盡液體，每五百萬至一千萬動(dòng)植物或酵母細(xì)胞，或一千萬細(xì)菌，加入1ml TRI Reagent。用槍吹打或適當(dāng) vortex，確保全部裂解。某些酵母和細(xì)菌如裂解不充分，可用勻漿器 勻漿，確保全部裂解。

（3）組織

           1)  植物組織：植物葉片直接放入研缽中，加入少量液氮，迅速研磨成粉末，每 50-100mg 植物葉片加入1ml TRI Reagent。

注：經(jīng)典模式植物如擬南芥、煙草、小麥、玉米等植物葉片能很好地提取 RNA；但一些多糖多酚植物，如西紅柿、棉花、毛白楊等，不能使用 TRI Reagent 提取 RNA。

           2)  動(dòng)物組織：按 10-30mg 組織加入 1ml TRI Reagent，用電動(dòng)勻漿器或者一次性研磨杵充分勻漿。

2、對(duì)于某些蛋白，多糖或脂含量很高的細(xì)胞或組織，TRI Reagent 裂解后可能會(huì)有不溶物或油脂狀漂 浮物。需 12,000g 4℃離心 10 分鐘，然后吸取澄清的裂解產(chǎn)物至一新的離心管中。

3、室溫放置 5 分鐘，使樣品充分裂解。

4、每毫升 TRI Reagent 加 0.2ml 氯仿，vortex 混勻或猛烈晃動(dòng) 15 秒，室溫放置 2-3 分鐘。

5、12,000g 4℃離心 15 分鐘，然后吸取含總 RNA 的上層無色水相至一新的離心管中， 每毫升 TRI Reagent 約可吸取 0.5-0.55ml。

6、加入與上清等體積的冰冷異丙醇，顛倒數(shù)次混勻，室溫沉淀 10 分鐘。如果希望提取 microRNA 等 小 RNA，推薦-70℃沉淀過夜。

7、12,000g 4℃離心 10 分鐘，在管底可見 RNA 沉淀，棄上清。

8、每毫升最初的 TRI Reagent 加入 1ml 75%乙醇(DEPC 水配制)，vortex 或顛倒混勻，

9、7,500g 4℃離心 5 分鐘，棄上清。再用離心機(jī)甩一下（>5,000rpm,  離心 1 秒），小心吸盡液體。

10、待 RNA 略干后，加入 20-50 μl DEPC 水溶解，-70℃凍存。注意：切勿讓 RNA 過分干燥，否則將 極難溶解，且測出的A260/280 值會(huì)低于 1.6。

注意事項(xiàng)：

1、需自備氯仿，異丙醇，DEPC，75%乙醇(DEPC 水配制)，和 DEPC 水。

2、所有離心管，槍頭及相關(guān)溶液都必須無 RNA 酶污染。耐高溫器物可 150℃烘烤 4 小時(shí)以去除 RNA 酶，其它器物去除 RNA 酶可考慮用 0.01%的 DEPC 水浸泡過夜，然后滅菌，烘干。溶液需用 DEPC 水配制。 加 0.01%(體積比) diethylpyrocarbonate(DEPC)至重蒸水或 MiliQ 級(jí)水中，處理過夜，滅菌即成 DEPC 水。

3、使用凍存的細(xì)胞或組織抽提總 RNA 的效果通常比新鮮的細(xì)胞或組織差一些。因?yàn)樵诩?xì)胞或組織凍融過程中一些細(xì)胞或組織內(nèi)的RNase 會(huì)被釋放出來并剪切樣品。如果不能及時(shí)抽提 RNA，推薦先加入適量 TRI Reagent，并裂解樣品后凍存。

4、必須戴一次性手套操作，且盡量不要對(duì)著 RNA 樣品說話，以防 RNA 酶污染。建議戴一次性口罩操 作。

5、TRI Reagent 含有毒物質(zhì)苯酚，避免接觸皮膚或吸入。為防止濺入眼睛，請(qǐng)戴防護(hù)眼鏡或使用透明 保護(hù)屏。如皮膚接觸 TRI Reagent，請(qǐng)立即用大量去垢劑和水沖洗，如仍有不適，請(qǐng)聽取醫(yī)生意見。

6、TRI Reagent 抽提總 RNA 的同時(shí)，理論上也可抽提蛋白和 DNA，但未經(jīng)測試。有興趣者可按 Invitrogen

公司的 TRI Reagent 的操作步驟進(jìn)行操作。

7、為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

 保存方法：

    4℃保存，一年有效。