快速銀染試劑盒 

產(chǎn)品簡介：

快速銀染試劑盒(Fast Silver Stain Kit)是一種快速簡單、可用于SDS-PAGE或非變性PAGE等蛋白銀染的試劑盒。本試劑盒也可以用于2D凝膠的銀染，并且染色后兼容后續(xù)的質(zhì)譜檢測。本試劑盒只需約90分鐘內(nèi)可以完成凝膠的銀染。對于BSA蛋白，檢測靈敏度可以達到0.3ng蛋白。

本試劑盒可足夠用于25塊常規(guī)的8×10cm凝膠的銀染。

   說明書后附有實驗記錄表格，方便記錄實驗步驟。

注意事項：

1、由于銀染非常靈敏，操作時請注意盡量使用高純度的水，并確保所使用的器皿非常清潔，最好使用潔凈的玻璃器皿。操作時必須戴手套，避免皮膚和凝膠直接接觸。

2、需自備乙醇、冰醋酸及MilliQ級純水或雙蒸水。

3、下述使用說明中各種溶液的使用量適用于大小為8×10cm厚度為0.75-1mm的凝膠。對于更大的凝膠，各種溶液的使用量需按凝膠面積的比例放大，對于更厚的凝膠，作用時間需按照厚度的比例適當(dāng)延長。

4、本說明書所指的常溫溫為20-25℃，操作溫度較低時由于溶液的擴散能力下降，各步驟需適當(dāng)延長時間。

5、銀染基本顯色液(10×)在低溫環(huán)境下可能會出現(xiàn)沉淀，可在30-37℃水浴中溶解，并充分混勻后使用。

6、為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用方法：

一. 固定步驟：

1、電泳結(jié)束后，取凝膠放入約100ml固定液中，在搖床上室溫搖動20分鐘，搖動速度為60-70rpm。固定40分鐘以上甚至過夜可以進一步降低背景。

固定液的配制：

2、 30%乙醇洗滌：

棄固定液，加入100ml 30%乙醇，在搖床上室溫搖動10分鐘，搖動速度為60-70rpm。  

30%乙醇的配制：

70ml MilliQ級純水或雙蒸水中加入30ml乙醇，混勻后即成100ml 30%乙醇。

3、水漂洗：

棄30%乙醇，加入200ml MilliQ級純水或雙蒸水，在搖床上室溫搖動10分鐘，搖動速度為60-70rpm。

二. 增敏步驟：

1、棄水，加入100ml銀染增敏液(1×)，在搖床上室溫搖動2分鐘，搖動速度為60-70rpm。

銀染增敏液(1×)的配制：

99 ml MilliQ級純水或雙蒸水中加入1ml銀染增敏液(100×)，混勻后即為銀染增敏液(1X)。銀染增敏液(1×)配制后需在2小時內(nèi)使用。

2、水漂洗(共2次)：

棄原有溶液，加入200ml MilliQ級純水或雙蒸水，在搖床上室溫搖動1分鐘，搖動速度為60-70rpm。 重復(fù)此步驟一次。

三. 銀染步驟：

1. 棄水，加入100ml銀溶液(1×)，在搖床上室溫搖動10分鐘，搖動速度為60-70rpm。

銀溶液(1X)的配制：

99ml MilliQ級純水或雙蒸水中加入1ml銀溶液(100X)，混勻后即為銀溶液(1X)。銀溶液(1X)配制后需在2小時內(nèi)使用。

2、水洗滌：

棄原有溶液，加入100ml MilliQ級純水或雙蒸水，在搖床上室溫搖動1-1.5分鐘，搖動速度為60-70rpm。

注意：水洗滌的時間不能超過1.5分鐘。

四. 顯色步驟：

棄水，加入100ml銀染顯色液，在搖床上室溫搖動3-7分鐘，直至出現(xiàn)比較理想的預(yù)期蛋白條帶，搖動速度為60-70rpm。 

五.  終止步驟：

1、棄銀染顯色液，加入100ml銀染終止液(1×)，在搖床上室溫搖動10分鐘，搖動速度為60-70rpm。終止時有氣體產(chǎn)生屬正?，F(xiàn)象，產(chǎn)生的氣體為二氧化碳。

銀染終止液(1×)的配制：

95ml MilliQ級純水或雙蒸水中加入5ml銀染終止液(20×),混勻后即為銀染終止液(1X)。銀染終止液(1X)配制后宜當(dāng)天使用。

2、水洗滌：

棄銀染終止液，加入100ml MilliQ級純水或雙蒸水，在搖床上室溫搖動5分鐘，搖動速度為60-70rpm。  

六. 保存：

可在MilliQ級純水或雙蒸水中保存?；虿捎眠m當(dāng)?shù)姆绞街苽涑筛赡z。

常見問題：

1、 背景太深：

（1）顯色時間過長。通常顯色反應(yīng)會在10分鐘內(nèi)結(jié)束，顯色反應(yīng)時間過長會導(dǎo)致背

景很深。

（2）洗滌不充分。洗滌時間過短，或洗滌液加入的量不足，或者容器過于狹小導(dǎo)致?lián)u動時溶液不易充分混合，或搖動速度過慢，導(dǎo)致混勻不充分。請按照說明書的建議確保各種溶液的用量和作用時間，搖床的推薦速度為60-70rpm。

（3）凝膠中原有的緩沖液等未在固定步驟中去除干凈。一方面需確保固定的時間和固定液的用量，另一方面對于不是最常用的Bis-Tris緩沖的凝膠需要更長的固定時間以充分去除凝膠中的原有緩沖成分，以降低背景。

（4）水的純度太低。需使用大于16 MΩ·cm的高純度水。

2、 蛋白條帶非常淺：

（1）蛋白的半胱氨酸(Cysteine)殘基的含量特別低或幾乎沒有。半胱氨酸殘基的存在對于銀染非常重要，半胱氨酸殘基的含量過低會導(dǎo)致檢測靈敏度下降。

（2）銀染后水洗滌時間過長。在銀溶液染色時需嚴(yán)格控制水洗滌的時間，水洗滌的時間不能超過1.5分鐘，否則會導(dǎo)致過多的銀離子被洗去，導(dǎo)致檢測靈敏度下降。

（3）樣量不足。本試劑盒檢測BSA的靈敏度可以達到0.3ng，對于不同的蛋白檢測靈敏度可能不同。對于一些蛋白可能需要大于1ng的蛋白量才能被檢測到。

（4）固定步驟后的洗滌不夠充分。導(dǎo)致少量乙酸殘留，影響后續(xù)檢測。確保30%乙醇洗滌和水洗滌的用量和時間，可以適當(dāng)延長洗滌時間。

3、凝膠上出現(xiàn)小點或或其它非蛋白的痕跡：

（1）凝膠沒有充分被溶液浸沒。請注意選擇大小合適的容器，并加入足量的各種溶液，同時需保持適當(dāng)?shù)幕靹蛩俣却_保凝膠可以被溶液浸沒。

（2）用于銀染的容器沒有充分洗滌干凈。容器需先用洗滌劑充分洗滌，隨后用自來水充分沖洗，最后用高純度水再洗滌數(shù)次。該容器最好能專用于銀染，并注意避免各種可能的蛋白污染。為確保充分洗滌干凈，對于耐硝酸的容器，例如玻璃容器，可以在上述洗滌劑及自來水洗滌后用50%硝酸洗滌，隨后用高純度水充分洗滌。

（3）指紋或其它壓痕。請注意戴手套操作，切勿直接接觸皮膚。操作時請注意盡量勿擠壓、折疊或摩擦凝膠。

（4）有金屬物質(zhì)接觸凝膠。金屬物質(zhì)例如金屬鑷子等接觸凝膠會出現(xiàn)非特異性痕跡。

4、在60-70 kD處出現(xiàn)一片模糊的蛋白染色背景：

皮膚上脫落的角蛋白(keratin)污染了蛋白樣品。一方面需注意戴手套操作，另一方面需注意盛放蛋白樣品的容器蓋子盡量不要敞開，甚至在取放蛋白樣品時在超凈臺內(nèi)進行以避免可能的角蛋白污染。

5、在凝膠的頂端處出現(xiàn)黃色背景：

（1）樣品中DTT濃度很高。采用其它適當(dāng)?shù)倪€原試劑，或者在許可范圍內(nèi)適當(dāng)減少DTT的用量。 

（2）采用Tris-Glycine-SDS電泳體系。Tris-Glycine-SDS電泳體系中的Glycine會導(dǎo)致背景凝膠的頂端出現(xiàn)輕微的黃色背景。

6、銀在染色器皿中出現(xiàn)沉淀：

染色器皿中可能含有殘余的洗滌劑或上次銀染時的殘余試劑。需確保把染色器皿洗滌干凈。

保存條件：